Che cos’è il Bioprinting e perchè è così importante per il futuro della medicina?

Tra le innumerevoli innovazioni tecnologiche che caratterizzano i nostri giorni troviamo certamente quelle che riguardano il settore biomedicale che, in fin dei conti, sono quelle probabilmente più rilevanti per tutti noi con i maggiori effetti positivi tangibili sulla vita dell’uomo. Nel corso degli anni abbiamo assistito all’introduzione di importanti innovazioni in medicina: dal cuore artificiale, alla macchina cuore polmone, dal pancreas artificiale alle terapie geniche. Uno dei più importanti aspetti di questo processo di innovazione è il Bioprinting.

Il Bioprinting è una tecnologia che deriva direttamente dalle comuni Stampanti 3D e, dunque, dall’ingegneria meccanica / industriale. Come spesso accade le innovazioni importanti che riguardano la medicina arrivano da discipline completamente diverse dalla medicina stessa. La multidisciplinarietà è un aspetto fondante dell’innovazione in generale.

Il Bioprinting è un sistema in grado di creare delle strutture 3D formate da cellule e da altri elementi che favoriscono la vita cellulare. In fin dei conti il bioprinting non è una grandissima novità: le stampanti 3D esistono da svariati anni e questa tecnologia si può dire ormai profondamente matura. La vera novità apportata dal bioprinting infatti non è tanto la tecnologia dietro a questa applicazione quanto i materiali utilizzabili per la stampa.

Parliamo infatti di stampa 3D di cellule, materiale extracellulare, matrici gel-viscose e biopolimeri.

PRIMA DEL BIOPRINTING

Nei laboratori di biologia cellulare di tutto il mondo gli studi di ricerca su cellule sono sempre stati condotti attraverso l’uso di cellule coltivate in 2D. Il termine “coltivate” sta ad indicare il processo con cui uno specialista (biologo, medico, biotecnologo, ingegnere biomedico) permette a poche cellule di replicarsi e di vivere nel tempo raggiungendo un adeguato livello di omeostasi (l’omeostasi in poche parole è il “benessere” della cellula). Le colture cellulari 2D (oggi ancora molto utilizzate) consistono nel depositare a mano (con appositi strumenti di deposizione) una certa quantità di cellule all’interno di vetrini circolari (chiamati “Petri Dish”) a formare una struttura piana del tutto “planare” sul fondo del vetrino. E’ pressochè impossibile con questo procedimento pensare di poter costruire delle strutture tridimensionali di cellule.

Nel corso del tempo ci si è accorti che i limiti delle colture cellulari 2D sono molteplici. Ad esempio:

  • la parte inferiore delle cellule a contatto con il vetrino non ha un adeguato scambio (ne di contatti cellulari, ne di nutrienti, ne di segnali chimici) con altre cellule.
  • La geometria del costrutto cellulare 2D è limitante rispetto a quanto si può ottenere con la costruzione di colture cellulari tridimensionali.
  • Le colture cellulari 2D molto faticosamente si aggregano autonomamente in strutture tridimensionali perchè dovrebbero lavorare contro forza di gravità.
  • Al contrario inoltre le colture cellulari 2D soggette alla forza di gravità saranno sempre e comunque a contatto con il vetrino e quindi limiteranno notevolmente le loro funzioni biologiche naturali.

Foto da: https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-70685-6_8- Differenza tra colture cellulari 2D e 3D

La stampa 3D risolve questi limiti trasformando quello che prima era un micro-cosmo bidimensionale in strutture tridimensionali di cellule che crescono così in un ambiente (a tre dimensioni) molto più aderente a quello reale. Negli organismi viventi le cellule infatti vivono aggregate in strutture che si trovano nello spazio 3D ed esse si aggregano in maniera diversa a seconda del punto dello spazio in cui si trovano.

Pensiamo ad esempio al cuore. Il cuore è costituito da diversi tipi cellulari che si trovano localizzati in diversi punti del’organo. Il miocardio ad esempio è costituito da cardiomiociti e si trovano nella parete del cuore. Le “cellule pacemaker” invece rappresentano la “centrale elettrica” del cuore che permette di attivare gli impulsi elettrici dell’attività cardiaca e si trovano negli atri e lungo il setto che divide il cuore sinistro dal cuore destro.

Come si vede, dunque, l’organizzazione spaziale delle cellule nello spazio tridimensionale è fondamentale per la loro vita e per la loro funzione. E’ evidente, quindi, che limitare un insieme di cellule a vivere in un sottile strato cellulare avente prevalentemente solo due dimensioni è decisamente fuorviante per lo studio del comportamento delle cellule stesse.

Il Bioprinting consente invece di creare delle strutture cellulari 3D spesso sostenute da impalcature chiamate scaffolds che permettono alle cellule di sorreggersi nel vuoto e di crescere in un ambiente tridimensionale. In questi costrutti 3D ogni cellula viene indirizzata a:

  • Differenziare in uno specifico tipo cellulare*;
  • “Dialogare” chimicamente con le altre cellule che si troveranno sopra, sotto, affianco, di lato ad essa;
  • Condizionare la propria geometria in base al contatto con le altre cellule e in base all’impalcatura (scaffold) sulla quale la cellula viene coltivata;

* le cellule staminali mesenchimali ad esempio sono cellule ancora in grado di differenziare in vari tipi cellulari. Ossia: una cellula staminale mesenchimale a seconda della direzione che ad essa viene imposta (biologicamente e chimicamente) può diventare una cellula del fefato (epatocita) oppure una cellule ossea (osteoblasta/osteoclasta) o, ancora, una cellula cardiaca (cardiomiocita).

Come sempre, per arrivare ad una innovazione in medicina, si parte dall’esigenza clinica. In questo caso l’esigenza stringente è stata quella di poter ottenere dei costrutti biologici composti da cellule che fossero quanto più vicini possibili a come le cellule si comportano nella realtà, ossia nell’organismo umano.

COME FUNZIONA IL BIOPRINTING

Il Bioprinting si realizza con l’uso di speciali stampanti 3D chiamate “Bioprinter” appositamente studiate e progettate per produrre oggetti biologici formati da cellule.

Questo è un esempio di Bioprinter:

Bioprinter Inkredible+ prodotta dall’azienda Cellink, attualmente da me utilizzata nei laboratori di ricerca dell’Ospedale Bambin Gesù di Roma

In linea generale una Bioprinter è formata da una serie di estrusori (normalmente siringhe) dai quali esce un materiale che può essere di varia natura (cellule, cellule + materiale extracellulare, supporto gel-viscoso con fattori di crescita per cellule, ecc…).

Le bioprinters entry-level di norma hanno un solo estrusore. Macchinari più avanzati arrivano ad avere anche 5 o più estrusori che possono lavorare contemporaneamente.

Avere un maggior numero di estrusori equivale a poter creare dei costrutti biologici composti da più materiali ed è questo un enorme valore aggiunto in questo settore.

Oltre agli estrusori ogni bioprinter dispone di un piatto di stampa che generalmente è molto più piccolo rispetto ai piatti di stampa delle normali stampanti 3D industriali. Tale piatto di stampa può essere riscaldato o raffreddato fino a temperature anche sotto lo zero. Il piatto di stampa della bioprinter di solito è una piastra di Petri che può essere lavata e sterilizzata all’occorrenza.

Le più avanzate bioprinters dispongono inoltre anche di sistemi di sterilizzazione integrati (filtri laminari) e sistemi di fotopolimerizzazione. Questi ultimi sono costituiti normalmente da luci LED a specifiche lunghezze d’onda che vanno a irrigidire alcune strutture gelatinose (cosiddette “fotosensibili”) sia durante che dopo la stampa.

In questo video vi mostro alcuni dettagli “tecnici” di una delle bioprinters che personalmente uso nel mio lavoro quotidiano:

BIOPRINTING e SCAFFOLDS

Ancora più interessanti però sono le Bioprinters che offrono la possibilità di stampare contemporaneamente sia cellule che scaffolds. Gli scaffolds, come già accennato precedentemente, sono delle impalcature sulle quali le cellule vengono “appese” e sostenute. Tali scaffolds ovviamente devono essere costituiti di materiale: a) biocompatibile b) biodegradabile.

Infatti molto spesso l’esigenza che abbiamo in laboratorio è quella di avere una impalcatura che non crei problemi alle cellule (biocompatibile) ma che dopo un certo periodo di tempo possa biodegradarsi (biodegradabile) in modo da lasciare spazio alle cellule che, in quel momento, avranno imparato ad autosostenersi.

E’ evidente, quindi, che la geometria dello scaffold condizionerà in maniera importante la geometria che le cellule assumeranno nel tempo. Questo è fondamentale per la rigenerazione tissutale.

L’uso degli scaffolds prevede principalmente due modalità:

  1. Scaffold stampati con cellule coltivate sopra di essi manualmente: in questo caso gli scaffold vengono stampati con una stampante 3D (non necessariamente della tipologia “bioprinter”) in materiali appositamente ricercati per la loro funzione. Successivamente tali scaffold vengono inseriti in apposite piastre di coltura e su di essi vengono deposte manualmente cellule.
  2. Scaffold stampati simultaneamente alle cellule: in questo caso gli scaffold vengono stampati dalla bioprinter contemporaneamente alla stampa 3D delle cellule. Il prodotto che si ottiene è quindi un costrutto biologico misto scaffold-cellule. Questo modo di operare costituisce un enorme vantaggio perchè si possono creare “sandwich” tra scaffold e cellule ma, più in generale, si possono creare geometrie miste scaffold-cellule che altrimenti sarebbe impossibile ottenere.

Tra le stampanti bioprinters di fascia alta (di livello assolutamente professionale) che consentono di ottenere la stampa simultanea di scaffold (biopolimero) e costrutto cellulare (cellule) abbiamo quelle della Regen-Hu azienda svizzera leader del settore.

Questa è la stampante BIOFACTORY™ di Regen-Hu. Attualmente la bioprinters più avanzata e completa presente sul mercato.

Le bioprinters più avanzate sono dei veri e propri “pezzi di laboratorio” mobili che oltre alla stampante contengono anche una cappa sterile, un sistema di controllo, di lavaggio e di pulizia. Gli investimenti necessario per l’acquisto di tale strumentazione superano i 300mila euro.

I VANTAGGI E I LIMITI DEL BIOPRINTING

Il Bioprinting è una tecnologia che mette in evidenza particolare i suoi vantaggi che sono principalmente quelli di poter creare delle parti anatomiche paziente specifiche con materiale cellulare paziente-specifico.

Con questo intendo dire che con questa tecnologia si possono creare parti di organo utilizzando un modello 3D dell’organo stesso ricavato dalle immagini radiologiche del paziente (TAC e/o Risonanza Magnetica). Questa parte anatomica 3D ricostruita (paziente-specifica) può quindi essere stampata con una bioprinter in materiale cellulare proprio del paziente (materiale cellulare autologo) con una serie di indiscutibili vantaggi per il paziente stesso (assenza pressochè totale di fenomeni di rigetto).

Il principale svantaggio generale che io vedo in questa tecnologia deriva dall’enorme complessità biologica che implica ricostruire da zero una parte anatomica funzionante con cellule del paziente.

E’ evidente che non è sufficiente poter stampare cellule cardiache di un paziente per poterne ricostruire l’intero organo. Nonostante i media a volte lancino titoli sensazionalistici in cui si paventano fantasiose stampe 3D di interi “organi” la realtà è ben diversa e direi che siamo ancora un po lontani da tale obiettivo.

Una delle difficoltà tecniche più rilevanti del bioprinting è la possibilità di stampare vasi sanguigni all’interno dei costrutti biologici che si creano. Il fenomeno della neoangiogenesi in una biostampa 3D è particolarmente complesso da gestire in quanto i vasi sono strutture talvolta decisamente piccole ma, soprattutto, cave. Le strutture cave sono particolarmente difficili da ottenere con stampanti 3D della serie FDM (Fused Deposition Modeling) alla quale appartengono anche tutte le bioprinters attualmente utilizzate in ricerca.

Si è visto, tuttavia, recentemente, che la neoangiogenesi può adeguatamente essere stimolata in maniera autonoma all’interno di costrutti stampati in 3D con particolari procedure chemiotattiche. La stampa 3D però di intere parti anatomiche contenenti vasi sanguigni di geometria specifica è tendenzialmente molto complessa.

DOVE E’ ARRIVATO IL BIOPRINTING OGGI

A parte gli aspetti tecnici è utile anche fare il punto della situazione e cercare di capire quali sono i risultati più importanti (almeno secondo il mio parere) raggiunti dal Bioprinting fino ad oggi.

Ovviamente sarebbe impossibile elencare tutti i progetti di ricerca che hanno raggiunto brillanti traguardi in termini di applicazione del bioprinting in medicina. Tuttavia ne ho scelti 2 che ritengo particolarmente emblematici e che, in un certo senso, ci fanno capire quali sono stati fino al 2019 i traguardi raggiunti dalla tecnologia del Bioprinting.

Rigenerazione del tessuto nervoso

La stampa 3D (scaffold) di una porzione di midollo spinale impiantato in un topo che ha consentito la riacquisizione della capacità motoria. Foto da: https://spectrum.ieee.org/the-human-os/biomedical/devices/this-3d-bioprinter-makes-a-spinal-cord-implant-in-16-seconds

Ricercatori di San Diego hanno prodotto uno scaffold di midollo spinale in un materiale molto semplice che si chiama GelMa (è una gelatina viscosa molto fornita di fattori di crescita) e l’hanno popolato con neural stem cells. Questo scaffold ha generato tessuto nervoso vero e proprio che ha ristabilito la funzione motoria in un topo precedentemente paralizzato. Questo è un filone di ricerca che, secondo me, porterà a risultati grandiosi.

Rigenerazione del tessuto cardiaco: stampa 3D di cardiomiociti

Un’immagine tratta dal lavoro del gruppo del Prof. Anthony Atala mostra come da 1 a 3 settimane il tessuto cardiaco stampato è riuscito a organizzarsi strutturalmente (in viola filamenti di alfa-actinina). In verde invece viene mostrata la conduzione elettrica evidenziata dai canali del calcio. Foto da: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6022829/

Uno dei più importanti centri al mondo che lavora da anni sul Bioprinting e sulla rigenerazione tissutale è quello a cui fa capo il Prof. Anthony Atala del Wake Forest Institute for Regenerative Medicine negli USA. Uno dei suoi lavori in particolare ha mostrato come l’attività contrattile di stampe 3D di cardiomiociti si generi spontaneamente in vitro e venga condizionata dall’induzione di bradicardia con carbacolo e tachicardia con epinefrina. Consiglio di dare un’occhiata a questo lavoro degno di nota.

CONSIDERAZIONI FINALI

La rigenerazione tissutale rappresenta la massima espressione del Bioprinting il quale si pone nell’ambito della ricerca biomedica come l’obiettivo più alto della medicina personalizzata.

L’idea di poter ricreare in laboratorio una porzione di organo funzionante da poter impiantare in un paziente è allettante per l’intera comunità scientifica internazionale.

Come tutti gli obiettivi ambiziosi però la meta non è ancora vicina. Tante sono ancora le sfide da affrontare per risolvere una serie di problemi tecnici e biologici non banali.

Governare i processi biologici in vitro è difficile, farlo attraverso le nuove tecnologie può esserlo ancora di più.

L’impressione generale che ho di questo settore è che ci sono obiettivi più difficili e obiettivi più facili da raggiungere. Negli obiettivi più facili da raggiungere a breve-medio termine vedo la rigenerazione del tessuto osseo. L’osso, come sappiamo, è una struttura complessa ma particolarmente affine ad essere riprodotta con tecnologie di produzione additiva (stampa 3D). In effetti la sua consistenza, il suo mix cellulare, i suoi fenomeni biochimici sono caratteristiche che si sposano molto bene con il Bioprinting e, infatti, siamo molto vicini dal poter creare osso a partire da cellule ossee autologhe. Il tempo in cui io suppongo questo obiettivo si possa raggiungere è circa 5 anni.

Negli obiettivi più difficili da raggiungere invece vedo la rigenerazione del muscolo cardiaco per una serie di motivi che riguardano la complessità della struttura biologica in questione. Oltre a rigenerare infatti il tessuto muscolare del cuore è necessario rigenerare anche tutto il tessuto di conduzione elettrica che trasmette l’impulso elettrico all’intera struttura cardiaca. Anche ad un non esperto sarà del tutto evidente che questo obiettivo è davvero difficile da raggiungere. Il tempo in cui io suppongo che questo obiettivo si possa raggiungere va da 10 a 15 anni.

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